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Un enfoque de microscopía forense para identificar partículas sub-visibles en una solución oftálmica estéril

FORMULACIÓN DE UNA SOLUCIÓN OFTÁLMICA



M. L. Ciolkowski, S. J. Ingham y B. J. Glass

La Farmacopea de los Estados Unidos (USP) establece que las soluciones oftálmicas deben estar libres de partículas visibles durante la inspección y cumplir con los requisitos de materia particulada subvisible especificados en el Capítulo ˂789˃ de la USP. En este estudio, los autores describen un enfoque de microscopía forense para caracterizar partículas que se observaron visualmente durante una prueba de estabilidad en condiciones de estrés de una formulación de solución oftálmica. Las partículas presentes en la formulación fueron químicamente identificadas a bajas partes por millón.

Este informe describe un enfoque de investigación microscópica para caracterizar las partículas que se observaron visualmente durante la prueba de estabilidad en condiciones de estrés de una formulación en solución oftálmica. Las soluciones oftálmicas tópicas deben estar "esencialmente libres" de partículas visibles tras la inspección, como se especifica en la United States Pharmacopeia (USP). También se requiere que las soluciones oftálmicas cumplan con requisitos de materia particulada sub-visible de acuerdo al Capítulo <789> de la USP al momento de la liberación del producto y durante las pruebas de estabilidad, para verificar la limpieza de la manufactura y la vida útil del producto terminado (1). El trabajo de caracterización analítica necesario en los casos en que se producen fallas de acurdo a USP <789>, se considera un análisis de rastreo o ultra-rastreo. Por ejemplo, el límite USP <789> para partículas de entre 10-25 μm es de 50 partículas/mL. En los casos en que se excede el límite debido a una partícula en forma de aguja de 20 micras con una densidad de 1.5 g/cm3, el nivel de partícula correspondería aproximadamente a 2 partes por billón (ppb) sobre una base de concentración para un tamaño de llenado de 5 mL. El aislamiento de partículas y las prácticas de enriquecimiento, junto con el análisis directo de muestras utilizando técnicas microanalíticas, son esenciales para la resolución productiva de problemas durante investigaciones por fallas de material particulado, debido a los niveles de concentración de trazas inherentes.

La microscopía forense utiliza un enfoque progresivo de resolución de problemas para obtener la máxima cantidad de información sobre el consumo animal de una cantidad mínima de muestra de una manera eficiente (2). La investigación sigue un enfoque cuidadoso y escalonado para limitar la contaminación o pérdida de trazas a lo largo de la vía de análisis. El mantenimiento de una conexión "ojo a muestra" durante el manejo de la muestra es también esencial. La progresión de la prueba suele seguir esta vía:

  • Inspección visual estereomicroscópica de baja potencia de la muestra para entender el contexto del defecto/fallo.
  • Aislamiento y enriquecimiento de las partículas que no cumplen o defectos; es esencial una muestra de control negativo.
  • Examen de microscopía de luz polarizada de bajo a alto poder, incluyendo análisis térmico.
  • Técnicas espectroscópicas seleccionadas, como la microspectroscopía infrarroja para materiales orgánicos y espectroscopia y microscopía electrónica de barrido-espectroscopia de energía dispersiva (SEM-EDS) para materiales inorgánicos
  • Confirmación de identidad con material auténtico, si está disponible. La información química de cada paso construye un cuerpo de evidencia para la asignación de identidad a lo desconocido. La información espectral de masa de las partículas puede obtenerse usando una sonda de análisis de sólidos atmosféricos.





Materiales y métodos
Muestras. La formulación de interés era una solución isotónica, tamponada y conservada de travoprost (0.04 mg/mL). Travoprost es un análogo sintético de prostaglandina F indicado para la reducción de la presión intraocular elevada. Los ingredientes de la formulación se enumeran en la Tabla I.

Se preparó una formulación de laboratorio de solución oftálmica de travoprost a pH 6.5 utilizando ingredientes comercialmente disponibles. Se colocaron alícuotas de la formulación en viales de vidrio con tapa y se almacenaron en un armario de estabilidad a 60ºC (Fisher Scientific, Incubadora Isotemp, Modelo 650D). Las muestras se examinaron visualmente a intervalos regulares.

Aislamiento de partículas y enriquecimiento. Se observó un precipitado visible en muestras preparadas en el laboratorio después del almacenamiento en vidrio a 60 ° C durante seis semanas. Las partículas se aislaron ya sea por centrifugación o por filtración a través de filtros de policarbonato recubiertos con oro (Whatman, Nuclepore, track etched, 13 mm, porosidad de 0.8 μm). Las muestras se centrifugaron durante aproximadamente 15 minutos a 2000 rpm usando una centrífuga de mesa (Fisher Scientific, accuSpin 1R). La filtración se llevó a cabo en una campana limpia Clase 100 utilizando utensilios de vidrio previamente limpiados. Las partículas aisladas se lavaron extensivamente con de agua filtrada (0.2 μm) antes del análisis para eliminar los componentes residuales de la formulación.

Luz polarizada y microscopia de etapa caliente. El uso de microscopía de luz polarizada por un microscopista experimentado es un poderoso método de identificación de muchos tipos de partículas ambientales comunes tales como fibras, escamas de piel y materiales celulósicos reconocibles a la vista.

Las partículas de la formulación se dispersaron en aceite con índice de refracción de 1.66 (Cargille Labs, calidad certificada) y se observaron microscópicamente con y sin luz polarizada (Nikon LV100 POL 100-400X) usando iluminación transmitida. Se llevó a cabo la microscopía en fase caliente (100x) desde temperatura ambiente hasta aproximadamente 250ºC con calentamiento a 10ºC/min utilizando una platina caliente Linkham (TMS 94, micromufla controlada). La observación microscópica durante el calentamiento se utilizó para identificar cambios de cristalinidad y eventos de fusión.





Microspectroscopía infrarroja. La microspectroscopía infrarroja puede utilizarse para la identificación de partículas individuales hasta de aproximadamente 20 μm mediante comparación del espectro infrarrojo de la partícula desconocida con bases de datos de una biblioteca espectral. Para partículas menores de 20 μm, los efectos de difracción se vuelven problemáticos y un microscopio Raman es más apropiado para el análisis espectroscópico. En este estudio, los espectros infrarrojos se recolectaron utilizando un espectrómetro infrarrojo Nicolet 6700 Fourier (FTIR) (Thermo Scientific) equipado con microscopio infrarrojo Nicolet Continuμm en modo de reflectancia usando filtros de policarbonato recubiertos de oro o de transmisión y usando placas de cloruro de sodio de 13 mm. Continuμm utiliza un objetivo de 32x y un condensador junto con un detector de mercurio- teluro de cadmio (MCT)-A y una platina motorizada x-y. Se utilizaron los siguientes parámetros de escaneo:

  • Rango de número de onda (cm-1): 4000-600 nominal
  • Modo de visualización: reflectancia o transmisión
  • Número de barridos: 64 o 256
  • Resolución (cm-1): 4
  • Apertura/iris de muestra: ~ 50 μm x 25 μm.

Se recogió un espectro de fondo inmediatamente después de analizar la muestra. El espectro de haz único de muestra, se normalizó a continuación para obtener el espectro de absorbancia adecuado. Los espectros se recogieron y se buscaron utilizando el software OMNIC 7.4.127 (Thermo Fisher Scientific, Inc.).

Análisis elemental por SEM-EDS. Las partículas se montaron sobre un portamuestras SEM de aluminio usando una lengüeta adhesiva de carbono. Antes del análisis, la muestra se recubrió por pulverización con ~2 nm de Au/Pd como control de carga. Las micrografías SEM y los espectros de dispersión de energía se recolectaron bajo condiciones de vacío estándar (alto) utilizando el microscopio electrónico de barrido FEI Quanta 400 y el espectrómetro de energía dispersiva (EDS) Oxford INCA X-sight. La configuración del análisis de la muestra se estableció a un voltaje de aceleración de 20KV para imágenes y EDS con una distancia de trabajo de 10 mm. Un haz de electrones enfocado fue rasterizado a través de la superficie de la muestra. El haz de electrones genera rayos X en el volumen de interacción haz-muestra bajo la superficie de la muestra; la profundidad fue de aproximadamente 1 μm. El análisis elemental se realizó midiendo la energía y la intensidad de las señales de rayos X que salen de la muestra generada por el haz de electrones. El detector EDS convierte la energía de cada radiografía característica en una señal de voltaje de tamaño proporcional.

Resultados y discusión
Se formó un precipitado visible en muestras preparadas en el laboratorio de soluciones de travoprost a una concetración de 0.04 mg/mL de pH 6.5 después del almacenamiento en viales de vidrio a 60ºC durante seis semanas. La formación de material particulado bajo condiciones de estrés indica un problema crítico de calidad del producto que afecta el desarrollo potencial, la seguridad y la longevidad de la formulación del producto. La identificación de la composición química de las partículas fue esencial para comprender el mecanismo de formación y mitigar el problema. La Figura 1 ilustra los pasos de una investigación de microscopía forense.

Caracterización de partículas mediante microscopía de luz polarizada y fase caliente.
Las partículas se aislaron por dos métodos. La centrifugación de la muestra fue una forma sencilla de concentrar las partículas y lavarlas de los componentes de la formulación residual. En algunos casos, las partículas también se aislaron por filtración a través de un filtro de policarbonato recubierto de oro. La membrana del filtro recubierta de oro hizo posible el análisis infrarrojo directo de las partículas a través de reflectancia especular.

Se dispersó una muestra del precipitado en aceite de IR de 1.66 sobre un portaobjetos limpio. El examen microscópico (Nikon LV100 POL 100-400X) reveló cristales en forma de aguja fina con birrefringencia débil. La mayoría de las partículas en forma de aguja tenían de 5 a 20 μm de longitud y aproximadamente 1 μm de diámetro (Figura 2); sin embargo, de vez en cuando, se observaron agujas mientras de aproximadamente 200 μm. El análisis térmico por microscopía en fase caliente reveló que las agujas se fundían entre 155-160 °C, lo que sugiere un estado cristalino. Basándose en la morfología de la aguja y en una densidad asumida de 1.5 g/cm3, se estimó que había 0.6 ng de material por partícula (Figura 3).





Microspectroscopía infrarroja. Las partículas individuales en aguja aisladas en un filtro de policarbonato recubierto de oro se analizaron por microspectroscopía infrarroja usando reflectancia especular fuera del recubrimiento de oro. Se muestra un espectro representativo en la Figura 4. El espectro de partículas se comparó contra bibliotecas espectrales infrarrojas y reveló una buena correlación con una sal de un ácido graso de alquilos de cadena, como se muestra en la Figura 5. El espectro de partículas de aguja tenía las siguientes características espectrales consistentes con una sal de ácido carboxílico: banda fuerte a 1540 cm-1 debido al estiramiento asimétrico del grupo CO2, bandas a 1470, 1415 y 1400 cm-1, debido a la vibración de estiramiento simétrica del grupo CO2. Los picos fuertes a aproximadamente 2900 cm-1 y a aproximadamente 2850 cm-1 se debieron a las vibraciones de estiramiento C-H asimétricas y simétricas de un alcano de cadena larga. El pico amplio a aproximadamente 3300 cm-1 era consistente con el estiramiento de O-H.

Análisis elemental por SEM-EDS.
Se sospecho de un precipitado de una sal de ácido graso como la causa de formación de partículas; por lo tanto, la composición elemental fue investigada usando SEM-EDS para identificar un potencial contraión. Se tomaron precauciones para enjuagar copiosamente los aislamientos de partículas de los componentes de la formulación antes del análisis. En la Figura 6 se muestra un espectro SEM-EDS representativo de las partículas en aguja. Se observó una respuesta fuerte y consistente para cinc (Zn) en el espectro de partículas en aguja, además de carbono y oxígeno. La formulación de travoprost se conserva con 0.025 mg/mL de cloruro de zinc (ZnCl2), el cual es la fuente probable del Zn2+ para la sal de ácido graso.

Formación de partículas a partir de soluciones de ZnCl2 y ácido 12-hidroxiesteárico para confirmar la identidad de las partículas en forma de aguja. Los datos de caracterización de partículas indicaron que el precipitado aislado de las muestras de estabilidad era consistente con una sal de zinc de un ácido graso de cadena larga. Una fuente lógica de ácido graso es el aceite de ricino hidrogenado de polietilenglicol (PEG)-40 usado como solubilizante del fármaco en la formulación. El ácido ricinoléico es el principal componente ácido graso en el aceite de ricino; su estructura se muestra en la Figura 7.

El ácido ricinoléico se convierte en ácido 12-hidroxiesteárico durante la hidrogenación del aceite de ricino. Entonces se produce el aceite de ricino hidrogenado PEG-40 a través de polietoxilación del aceite de ricino hidrogenado. Los grupos éster resultantes pueden ser susceptibles a la hidrólisis y liberar así ácido hidroxiesteárico. Esta hidrólisis es una vía de degradación potencial del excipiente y podría dar como resultado ácido hidroxiesteárico libre en la formulación de travoprost. El ácido hidroxiesteárico también podría estar presente en el aceite de ricino hidrogenado PEG-40 como una impureza de bajo nivel, debido a que los derivados de aceite de ricino tienen especificaciones de índice de acidez para el control del contenido de ácido carboxílico de la materia prima.

Basándose en esta hipótesis, se llevó a cabo un experimento de simulación utilizando ácido 12-hidroxiesteárico (12-HSA) adquirido de una fuente comercial (TCI America, Part # H0308). La adición de unos pocos mL de solución de 12-HSA en alcohol isopropílico a una solución acuosa de 5 mg/mL de ZnCl2, dio como resultado una rápida formación de partículas visibles. Las partículas de ZnCl2/12-HSA se aislaron de la solución y se secaron. Los espectros infrarrojos de estas partículas se compararon con los del precipitado aislado de la formulación de travoprost (Figura 8). Los espectros infrarrojos del precipitado simulado son casi idénticos a los desconocidos y proporcionan una fuerte evidencia de que las partículas que se formaron en la formulación de travoprost pertenecen a una sal de zinc de ácido hidroxiesteárico.







Conclusión
Las partículas que se formaron en una solución oftálmica durante el almacenamiento de estabilidad acelerada a 60ºC se identificaron como una sal de zinc de ácido hidroxiesteárico. El ácido hidroxiesteárico estaba presente en la formulación como una impureza ácida libre o un producto de hidrólisis de aceite de ricino hidrogenado PEG-40. El zinc está presente en la formulación como parte del sistema conservador. Se utilizó un método de microscopía forense para identificar químicamente la partícula en cuestión presente en la formulación a bajos niveles de ppm. Estos datos fueron fundamentales para la comprensión de una cuestión importante que afecta al desarrollo de la formulación.

Agradecimientos
Los autores agradecen a Steve MacLeod y Brian Rohrs por leer críticamente este manuscrito y por muchas discusiones útiles.

M. L. Ciolkowski es científico principal; S. J. Ingham es científico y B. J. Glass es investigador senior, todos en Pharmaceutical Technical Services, Bausch & Lomb (Una división de Valeant Pharmceuticals) Rochester, NY 14609.

Recibido: 29 de agosto de 2016. Aceptado: 22 de septiembre de 2016.

Referencias
USP General Chapter <789> “Particulate Matter in Ophthalmic Solutions” (US Pharmacopeial Convention, Rockville, MD, 2012).
D.S. Aldrich and M.A. Smith, Applied Spectroscopy Reviews, 34 (4) 275–327 (1999).
PT

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