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Sistema de neutralización de superficie Un método nuevo, robusto, para la elución de proteínas de cerámica de hidroxiapatita

INVESTIGACIÓN ARBITRADA: PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

Mark A. Snyder, Daniel Yoshikawa y Larry J. Cummings

La hidroxiapatita se utiliza para el fraccionamiento y purificación de una am-plia variedad de moléculas biológicas. A escala comercial, la liberación de protones durante la elución puede denigrar el desempeño de la cerámica hi-droxiapatita. Los autores desarrollaron una metodología simple utilizando un solo paso adicional con buffer llamado sistema de neutralización de superficie (SNS) que remueve estos protones hasta un pH casi neutro. La inserción del paso SNS no altera las propiedades básicas deseadas de la cerámica de hidroxiapatita.

La hidroxiapatita es una forma única del fosfato de calcio usada para el fraccionamiento y purificación de una amplia variedad de moléculas biológicas, tales como las subclases de la IgG, las enzimas, los fragmentos de anticuerpos, y los ácidos nucleicos (1). La croma-tografía en hidroxiapatita puede usarse como un paso de pulido para separar otras molé-culas que, por el contrario, se copurifican detenidamente (2-5, 6) o para la purificación inicial de muestras crudas (6). La cerámica de hidroxiapatita se fabrica a través de la sin-terización y el tratamiento con calor de cristales de hidroxiapatita, formando así una forma esferificada, robusta, fácil de empacar (7).

El CHT es una resina en modo mezclado. Los iones de calcio de la superficie se enlazan ya sea a conglomerados de carboxilo o a grupos fosforilo en las moléculas blanco en un mecanismo del tipo de afinidad metálica. Los grupos fosfato en la superficie, por otro lado, interactúan con las aminas u otros grupos cargados positivamente en la superficie de las proteínas (o de otras moléculas) a través de un mecanismo clásico de intercambio catiónico. El CHT se utiliza para purificar muchos bioterapéuticos fabricados y para las proteínas generales, debido a su superior eliminación de todas las impurezas de la co-rriente del proceso (p.ej., agregados, proteínas de células huésped, virus, endotoxinas, proteína A y ADN).

A escala comercial, la liberación de protones durante la elución puede impedir el desempeño del CHT. La superficie del CHT bajo condiciones típicas del proceso tiene un alto grado de protonación sobre los grupos fosfato de la superficie (ver Figura 1) (8). Estos protones pueden cambiar de lugar con otros cationes en la fase móvil. Cuando aumenta la concentración de cationes (p.ej., los pasos del gradiente van de fuerza iónica baja a fuerza iónica alta), los protones se liberan a la fase móvil, reduciendo temporalmente el pH de la solución. Esta liberación se ha expresado en un modelo matemático (9). Dichas excur-siones sin control del pH pueden, en las corridas largas, denigrar el desempeño del CHT (10, 11).

La excursión del pH podría eliminarse si los protones fueran reemplazados por otros cationes, convirtiendo así todos los hidroxilos del fosfato en su forma de sal (p.ej., sodio) y formando agua de los protones (ver Figura 2). Tomando este concepto, se desarrolló una metodología simple utilizando un solo paso adicional de buffer, inmediatamente antes de la elución, el cual remueve los protones hasta un pH casi neutro. Esta tecnología pendiente de patente se llama sistema de neutralización de superficie (SNS) y es mecanísticamente similar a la acción que se muestra en la Figura 2, excepto que el agua proporciona los hidroxilos neutralizantes. Este artículo presenta datos que demuestran que la técnica SNS prolonga significativamente la vida útil del CHT (es decir, mejora la robustez) y evita que el pH caiga durante la elución sin desorber la proteína blanco cuando ésta es un anticuerpo monoclonal. Los datos también demuestran que esta tecnología no afecta los resultados de calidad comunes, típicamente monitoreados durante la purificación del anticuerpo.


Figura 1: Química de superficie de la cerámica de hidroxiapatita con unión reversible de los protones a la superficie, bajo la influencia de cantidades ascendentes o descendentes de cationes, en este caso, del sodio.

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