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Sensibilidad de las proteínas al tungsteno El efecto del pH y la fuerza iónica sobre la agregación de proteínas

AGREGACIÓN DE PROTEÍNAS



Vinod Vilivalam, Lloyd Waxman y Tadd Steeley

La agregación de proteínas en productos terapéuticos puede causar severas respuestas inmunes en los pacientes. Las partículas de tungsteno y de aceite de silicón en jeringas prellenadas han demostrado que causan agregación de proteínas. Los autores investigan el efecto del pH bajo y de la fuerza iónica sobre la agregación, utilizando mediciones de la turbidez y cromatografía de líquidos de alta resolución con exclusión por tamaño (SEC). Los autores también comparan las jeringas de vidrio y plástico en términos de los niveles de tungsteno y aceite de silicón presentes.

La agregación de proteínas en los productos terapéuticos tiene el potencial de causar severas respuestas inmunes en los pacientes. Se ha reportado que el aceite de silicón, el cual es usado para lubricar las jeringas prellenables de vidrio, induce la agregación de proteínas, y en varios casos, la agregación de proteínas terapéuticas ha sido atribuida a la presencia de partículas de tungsteno en jeringas prellenadas (1, 2). El origen del tungsteno en las jeringas de vidrio prellenadas parecen ser los depósitos del vapor de óxido de tungsteno en el área del embudo de la jeringa proveniente de los vástagos de tungsteno calentados, usados para producir el canal a través del cual se monta la aguja (3). Dos recientes estudios in vitro han identificado las condiciones requeridas para inducir la agregación de proteínas por tungsteno y han demostrado que los polianiones de tungsteno solubles que se generan en pH ácido son responsables de la agregación de proteínas inducida por el tungsteno (4, 5, 6). Además de ser principalmente electrostática por naturaleza y dependiente de la concentración tanto de proteína como de tungsteno, la interacción es parcialmente reversible, y los cálculos han demostrado que la proteína co-precipita politungstato como complejo de carga neutra (5). Ambos reportes utilizaron especies de tungsteno soluble de fuentes comerciales y concluyeron que el tungstato de sodio (Na2WO4) acidificado era el más potente. Los extractos preparados de vástagos de tungsteno usados también fueron efectivos para inducir la formación de agregados de proteína (4).

Las mediciones de turbidez y la cromatografía de líquidos de alta resolución con exclusión por tamaño (SEC) pueden ser usadas para monitorear la agregación por el Na2WO4. Bajo las condiciones extremas de bajo pH y fuerza iónica usados para investigar este fenómeno en este estudio, la mayoría de las proteínas son susceptibles de precipitación por el tungsteno soluble. Los datos sugieren que la carga neta en una proteína es un predictor de precipitación por el tungsteno. El estudio también muestra la ausencia de aceite de silicón y tungsteno en jeringas prellenadas hechas de plástico. Para proteínas sensibles a la agregación por tungsteno o aceite de silicón, las jeringas de plástico son una alternativa atractiva para las jeringas hechas de vidrio.

Materiales y métodos
Preparación de reactivos. Se evaluó la sensibilidad a la agregación por tungstato incubando proteínas en concentraciones de 0.1 – 1 mg/mL a pH 4-7 con tungstato en 1 – 100 ppm. Los buffers usados en este estudio tuvieron una concentración de 20 mM: el acetato de sodio se utilizó en pH 4.0, 4.5, 5.0 y 5.5, el citrato de sodio se utilizó en pH 6.0 y el fosfato de sodio en pH 7.0. Se prepararon soluciones patrón de tungstato en una concentración de 10,000 ppm disolviendo polvo de tungstato de sodio en cada buffer y reajustando el pH. Se prepararon otras concentraciones mediante diluciones seriadas de las soluciones de 10,000 ppm. Se prepararon soluciones patrón de NaCl 1M en cada pH para estudiar el efecto de la fuerza iónica sobre la precipitación de proteínas por el tungstato.

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