Determinación de la oxidación de proteínas inducida durante las operaciones de llenado-terminado

Después de la descontaminación, la concentración del VPHP en la cámara se reduce a un nivel objetivo, el cual normalmente se establece en 1 ppm o menos, a través de un extenso intercambio de aire (fase de aireación) antes del llenado. Incluso en concentraciones por debajo de las ppm, sin embargo, el VPHP puede difundirse dentro de las soluciones acuosas de proteína que se están llenando en la cámara y que potencialmente impactan la calidad del producto farmacéutico. El VPHP residual puede ser problemático especialmente para productos farmacéuticos de proteína liofilizados, sensibles a la oxidación, con la cual los viales permanecen medio abiertos durante muchas horas en los aisladores de llenado y transferencia hasta que se cargan en el liofilizador. La adición de diferentes cantidades de HP dentro de la formulación propuesta seguida por un estudio de estabilidad se utiliza a menudo para evaluar la sensibilidad del producto de proteína a la oxidación y posteriormente para definir su límite de exposición al HP en los aisladores (2).

La proteína Z era un producto liofilizado y su proceso de llenado-terminado había sido transferido a una nueva línea de llenado que estaba albergada en aisladores. El VPHP se utilizó para la descontaminación y el objetivo del HP para la fase de aireación se estableció en 0.5 ppm o menos. Los primeros estudios con un producto similar mostraron que la concentración máxima del HP que se difundía en un vial medio tapado en el aislador durante 24 h era aproximadamente de 0.04 ppm. El efecto del HP residual sobre la Proteína Z fue estudiado sistemáticamente adicionando a la solución a granel formulada con 0 (control), 0.04, 0.08, y 0.20 ppm de HP acuoso. Después de mantener a temperatura ambiente durante 24 h, estos viales llenos fueron liofilizados y se estudiaron sus estabilidades durante 6 meses a temperatura ambiente así como a 5°C. Las concentraciones de HP más elevadas (hasta 3 ppm), que no eran relevantes para la manufactura, también se incluyeron en el estudio de adición para la elucidación del mecanismo, pero no se incluyeron en los estudios de estabilidad.

Materiales y métodos
El estándar de HP (3%), catalasa y otros químicos para el ensayo fueron de Sigma. La concentración de HP se midió utilizando un ensayo desarrollado por el laboratorio utilizando peroxidasa y 3,3’,5,5’-tetrametilbencidina (TMB) como sustrato. La agregación de proteínas se determinó utilizando SEC-HPLC con columna TSKgel G3000SWXL. La actividad de la proteína se midió utilizando un ensayo cinético interno. La oxidación de la proteína se midió después de la digestión utilizando HLC en fase reversa y espectrometría de masas en el modo seleccionado de monitoreo de iones. La oxidación de la proteína se expresó como el porcentaje de oxidación de metionina del residual más lábil de metionina, el cual fue predeterminado en la molécula de la Proteína Z.

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