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Evaluación de usos prácticos de la ingeniería isotópica molecular
La síntesis isotópica dirigida de los autores es un ejemplo de cómo la ingeniería isotópica molecular puede ser usada para pre-determinar los rangos isotópicos discretos de los productos biofarmacéuticos.
INVESTIGACIÓN ARBITRADA
John P. Jasper, Peter Farina, Ann Pearson, Peter Mezes y Anthony Sabatelli
La ingeniería isotópica molecular (MIE) es la síntesis dirigida a isótopos estables de productos químicos para la autenticación y seguridad del producto, así como la protección de la propiedad intelectual. En pruebas que involucran la manufactura del naproxeno, los resultados mostraron una correspondencia generalmente excelente entre los resultados observados y los pronosticados como isotópicos estables (δ13C, δ18O y δD) para la síntesis dirigida de una mezcla racémica a partir de sus precursores inmediatos. Los resultados observados de carbón-isotópico pueden ser fácilmente explicados por las leyes del balance de masas y el balance de masa del isótopo. Los resultados del oxígeno y el hidrógeno isotópico, sin embargo, requieren evaluación adicional de los efectos del intercambio del oxígeno e hidrógeno.
Un estudio previo con el Departamento de Análisis Farmacéutico de la FDA mostró que los fabricantes individuales del naproxeno podrían ser fácilmente diferenciados por su procedencia (δ13C, δ18O y δD) isotópica estable. Los resultados de dos de tres de las muestras en el último estudio correspondieron bien con los resultados previos, sugiriendo que el MIE puede ser fácilmente usado sin alterar los procesos de manufactura aparte de seleccionar y/o monitorear isotópicamente los reactivos y productos.
La autenticación de productos, la seguridad del producto y la protección de la propiedad intelectual (IP) siguen siendo problemas mayores en la industria biofarmacéutica (1-6). La síntesis dirigida isotópica estable de productos químicos permite la composición isotópica estable de materiales a ser predeterminados para abordar estos desafíos (5). La autenticación del producto se realiza típicamente en tres niveles: abierto, encubierto y forense (7). La ingeniería molecular isotópica (MIE) toma un enfoque forense o analítico, analizando isótopos estables en estos productos. Los isótopos estables que abundan en la naturaleza son trazadores naturales que se presentan en toda la materia (8).
El trabajo inicial con la FDA sobre la caracterización del producto naproxeno reveló la procedencia de nivel isotópico del fabricante de esta pequeña molécula analgésica (1,9), el cual fue referido como “la huella digital del fabricante”. Esta procedencia isotópica representó la convergencia de los efectos de las composiciones isotópicas estables de los materiales de inicio y los efectos isotópicos del proceso de síntesis. Más que solamente aceptar los efectos aleatorios del origen variable y el proceso sintético sobre las composiciones isotópicas estables de los productos. El MIE toma un enfoque proactivo, que dirige a propósito la composición isotópica estable de los productos biofarmacéuticos.
La principal justificación para el MIE es diseñar los rangos isotópicos de los productos para la identificación del producto y la seguridad, y también por consideraciones de la IP. Como ejemplo del MIE, los productos isotópicos de una última etapa de la síntesis del naproxeno (Ecuación 1) fueron analizados:
La pre-selección de tres diferentes composiciones isotópicas estables del material de inicio, 2-Bromo-6-metoxinaftaleno dio productos racémicos del naproxeno de tres rangos discretos isotrópicos estables. El naproxeno MIE resultante es diferente a partir de la sustitución que tendría lugar en el etiquetado de deuterio, en el cual un isótopo diferente se sustituye en una sola posición (10). La síntesis isotópica dirigida por los autores es sólo un ejemplo de cómo el MIE puede ser usado para predeterminar los rangos isotópicos discretos de productos biofarmacéuticos.
En un principio, el enfoque del MIE debería ser adaptado fácilmente a las operaciones de manufactura biofarmacéutica.
El único ajuste a un proceso de manufactura existente sería el uso de materiales de inicio o intermedios sintéticos de composiciones pre-medidas isotópicas estables. El aparato de manufactura permanecería sin cambios. Este enfoque podría tener amplia aplicación en el aseguramiento de la identidad del fármaco y la procedencia de la planta de manufactura al consumidor. Las Tecnologías de Isótopos Moleculares han desarrollado cuatro generaciones patentadas o pendientes de patente de métodos y tecnologías isotópicos estables (5):
- Caracterización de producto (tanto para moléculas pequeñas como biológicos) (6, 9, 10)
- Caracterización del proceso (notablemente, protección de la patente del proceso) (12)
- Análisis en proceso (continuo) (5)
- Ingeniería isotópica molecular o MIE (5).
Diseño experimental
Se analizaron tres grupos de muestras para examinar las composiciones isotópicas estables que abundan en la naturaleza, para la síntesis de naproxeno, incluyendo los dos reactantes (2-bromo-6-metoxinaftaleno y ácido bromopropiónico) y el producto final (naproxeno racémico).
Síntesis del Naproxeno. La última etapa de la síntesis del naproxeno se llevó a cabo por IsoSciences, LLC (King of Prussia, PA) como se muestra en la Figura 1.
Reactantes. Se colectaron ocho muestras de 2-bromo-6-metoxinaftaleno de una selección mundial de proveedores (Tabla I). Se adquirió un reactivo de Grignard (ácido bromopropiónico) de Sigma-Aldrich (St. Louis MO). Tres de las muestras de 2-bromo-6-metoxinaftaleno, de CombiBlocks, Matrix y Aesar, fueron seleccionadas para este estudio basado en sus diferentes composiciones de 13C: una alta, una baja y una intermedia. Las muestras del Naproxen racémico fueron sintetizadas a partir de los tres diferentes materiales de inicio.
Formación de Grignard. El 2-bromo-6-metoxinaftaleno fue disuelto en un matraz de fondo redondo con tolueno anhidro y tetrahidrofurano (THF) anhidro, con calentamiento y gasificación. La solución de bromonaftaleno se agregó gota a gota al magnesio a través de un embudo de adición. Se dejó enfriar la reacción a temperatura ambiente bajo nitrógeno.
Formación de la sal de magnesio en ácido bromopropiónico. El ácido alfa-bromopropiónico fue disuelto en THF anhidro. La solución se enfrió a -15°C en un baño de hielo seco/acetona y se añadió cloruro de metil magnesio a través de una jeringa manteniendo mientras tanto la temperatura por debajo de 0°C. La temperatura se mantuvo por debajo de 0°C hasta que se usó la solución.
Reacción de acoplamiento. La solución de Grignard se transfirió a un matraz de fondo redondo con dos cuellos con un termómetro y un septum a través de la cánula y después fue degasificada. La solución se enfrió en un baño de hielo, y el complejo de haluro de magnesio mezclado se agregó a través de la cánula, manteniendo la temperatura a 15-20°C. La reacción se detuvo después de 2 horas. La solución resultante se enfrió posteriormente en un baño de hielo y se añadió una solución de 10 mL de HCl 12N en 75 mL de agua. Después de agitar durante cinco minutos, se filtró la mezcla bifásica, y el filtro se lavó con 25 mL de tolueno y 25 mL de agua.
Se separaron las capas y la fase orgánica se extrajo con 2 x 75 mL de solución de NaOH al 10%. Los extractos básicos fueron combinados, lavados con tolueno (∼25 mL) y filtrado. Al filtrado se le agregó 7.5 mL de metanol y 6 mL de tolueno. Esta mezcla fue acidificada después con HCl concentrado hasta un pH de 5. La pasta resultante fue calentada con reflujo durante una hora y se dejó enfriar durante la noche con agitación. El producto se lavó con 10 mL de agua, 2 x 2 mL de tolueno y 2 x 2 mL de hexano, y se secó para dar un sólido crema. Después del secado bajo alto vacío durante 48 horas, hubo 5.8828 g (53% de rendimiento).
Análisis isotópico estable. Se hicieron tres mediciones isotópicas estables (δ13C, 18δO y δD) fueron hechas de cada uno de los componentes de este estudio. En el estudio de sondeo del material de inicio, se midieron tres relaciones isotópicas estables en cada una de las ocho muestras de 2-bromo-6-metoxinaftaleno en análisis triplicados (es decir, 8 lotes x 3 relaciones isotópicas x 3 réplicas = 72 mediciones) para evaluar la precisión analítica (13).
Se hicieron nueve mediciones isotópicas análogas en el reactivo de ácido bromopropiónico (3 relaciones isotópicas x 3 replicados). Los análisis triplicados también se llevaron a cabo para cada una de las tres relaciones isotópicas de los cinco lotes de naproxeno sintetizados aquí, dando 45 mediciones isotópicas. Por lo tanto, en este estudio se hicieron un total de 126 mediciones isotópicas estables de las muestras.
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