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Avances de la Tecnología ZFN en la Manufactura Biofarmacéutica
Aplicaciones de la tecnología ZFN en la ingeniería de líneas celulares biofarmacéuticas.
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Aplicaciones de la tecnología ZFN en la ingeniería de líneas celulares biofarmacéuticas.
La edición del genoma ha jugado un papel prominente en el desarrollo de células de Ovario de Hámster Chino (CHO) para los procesos biofarmacéuticos. La línea celular DUKXB11 fue creada en 1980 introduciendo mutaciones en el locus de dihidrofolato reductasa (DHFR). Aunque las células construidas no estaban destinadas para la producción de proteína recombinante estable, la modificación DHFR proporcionó un potente marcador de selección metabólica, y la línea celular fue rápidamente usada para crear pools establemente transfectados.
Conforme el conocimiento del genoma del CHO se ha incrementado, se han identificado muchos más blancos genómicos potenciales. La edición genómica es actualmente usada de manera rutinaria como herramienta para ayudar a la producción biofarmacéutica. Cuando la línea celular DUKXB11 se desarrolló en 1980, las únicas técnicas de modificación genómica disponibles eran la exposición a mutágenos químicos o la radiación. Los métodos de detección masiva y selección fueron por lo tanto requeridos para identificar células con el genotipo deseado. Las mutaciones en la línea celular DUKXB11 fueron introducidas exponiendo las células CHO a etil metansulfonato o a radiación gamma. Las células pasaban por muchas rondas de selección utilizando [3H] deoxiuridina para aislar clones que contuvieran el genotipo deseado. Estas técnicas de mutagénesis podían introducir mutaciones aleatorias indeseables a través del genoma y requerir estrategias de selección masiva para identificar los clones con el genotipo deseado. Hoy día, existen varias tecnologías que le permiten al usuario editar el genoma con más precisión. Una de estas tecnologías es el uso de nucleasas con dedos de zinc (ZFNs, del inglés zinc finger nucleases).
Las ZFNs le apuntan a una secuencia específica del ADN y crean una rotura de la doble cadena (DSB, del inglés double stranded break) en esa ubicación precisa.
Nucleasas con dedos de zinc
Un motivo del dedo de zinc es una proteína pequeña que se presenta de manera natural hecha de aproximadamente 30 amino ácidos, estabilizada por al menos un ion de zinc. Cada motivo del dedo de zinc se une a una serie específica de tres bases de nucleótidos. Cuando varios de estos motivos de dedos de zinc están conectados, le apuntan a una secuencia genómica precisa. Un ZFN se forma cuando una FokI endonucleasa se fusiona a estos motivos de dedos de zinc.
Los ZFNs están diseñados en pares que se unen a secuencias adyacentes. Cuando el par de ZFNs se unen a las secuencias adyacentes, sus FokI endonucleasas se heterodimerizan, cortando el ADN en esa ubicación. En otras palabras, los ZFNs se dirigen a una secuencia específica del ADN y crean una rotura de la doble cadena (DSB) en esa ubicación precisa.
Una vez que la DSB ha sido creada, el usuario puede entonces crear supresiones o inserciones específicas en ese sitio, utilizando los mecanismos de reparación naturales de la célula. La precisión y exactitud de los ZFNs reducen los procesos de separación y selección necesarios para identificar células con el genotipo deseado, reduciendo los tiempos.
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