Métodos para la Manufactura Automatizada deInmunoterapia de Células Dendríticas Autólogas

Los otros dos esquemas involucran el aislamiento de células precursoras y su cultivo para generar las DCs. Estas células precursoras son ya sea células madre hematopoyéti-cas (HSCs) o monocitos. Las HSCs requieren tiempos de cultivo más prolongados para generar DCs en comparación con los monocitos y requieren que el paciente sea movilizado (p.ej., pre-tratamiento con factor estimulante de colonias de granulocitos) antes de la leucaféresis. La ventaja del esquema de HSC es la capacidad para proliferar las células antes de la diferenciación. Los monocitos reducen el tiempo de cultivo y la manipulación en comparación con las HSCs con la limitación de que las células no tienen capacidad de proliferación. Por lo tanto, la clave para el procesado de las DC autólogas a partir de los monocitos, es el manejo de las pérdidas y la optimización de los recobros en cada paso para asegurar un proceso eficiente.

Generación de una inmunoterapia con células dendríticas
Utilizando monocitos, Argos Therapeutics desarrolló un método robusto para la generación de su terapia DC autóloga a partir de leucaféresis para estudios clínicos en las indicaciones de carcinoma de células renales (RCC) y virus de inmunodeficiencia humana (VIH) (ver Figura 1). Los monocitos se aíslan de la leucaféresis utilizando el Sistema de Separación de Células Elutra (Caridian BCT). Este instrumento utiliza elutriación, también conocida como centrifugación a contraflujo, para fraccionar las células en la leucaféresis basada principalmente en el volumen celular, proporcionando de esta manera una fracción final de monocitos enriquecidos. Estos monocitos pueden ser cultivados inmediatamente para generar DCs, o pueden congelarse para descongelarse después y cultivarse con factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) e interleucina 4 (IL-4) durante 5 días para generar DCs inmaduras en bolsas de cultivo. Al medio de maduración que contiene factor α de necrosis tumoral, se le agrega interferón γ y prostaglandina E₂, y las DCs son cultivadas durante la noche para madurar antes de introducir el antígeno.


Figura 1: Panorama general de un proceso de manufactura de células dendríticas autó-logas para indicaciones en oncología y enfermedades infecciosas.

El antígeno se agrega a las DCs en forma de ácido ribonucleico (RNA) utilizando elec-troporación (electropermeación). Los RNAs del antígeno son amplificados para cada pa-ciente a partir de muestras de su tumor o virus (1, 2). Este método provee antígeno que es único para ese individuo y confecciona la inmunoterapia DC para ese individuo. Esta técnica, sin embargo, hace la manufactura más compleja que los esquemas alternativos en los cuales el antígeno es universal para todos los pacientes y puede fabricarse en can-tidades a granel. El RNA es fabricado para cada paciente aislando el RNA total del tumor o viral de la muestra del paciente. Ese RNA aislado se convierte a cDNA de primera banda a través de transcripción inversa y se amplifica por medio de la reacción de la cadena de polimerasa (PCR) utilizando primers y métodos no específicos para la secuencia, ha-ciéndolos así universales para todas las muestras. El RNA es generado utilizando el cDNA resultante amplificado a través de una reacción de transcripción in vitro (IVT) y es tapado post-transcripcionalmente para asegurar alta eficiencia de tapado. Utilizando este proceso, se generan consistentemente miligramos de RNA mensajero (mRNA) del RCC amplificado a partir de microgramos de RNA total. Para el VIH, son amplificados los RNAs de las cuasi-especies de proteínas gag, vpr, rev y nef en la muestra viral (2). Del RNA viral aislado, cuya concentración no puede ser medida mediante métodos espectrofotométrico estándar, se amplifican miligramos de RNA para cada antígeno para cada paciente.

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