Determinación de niveles bajos de PPB de nitritos en excipientes poliméricos

Los métodos comunes para cuantificación de nitritos en principios activos farmacéuticos y productos farmacéuticos se basan en cromatografía de intercambio iónico (CI) acoplada con detección ultravioleta (UV), electroquímica (EQ), conductividad (CD) y, con menor frecuencia, espectrometría de masas (EM) (10-12). Tanto detección UV como conductividad se utilizan comúnmente para el análisis de agua potable, proporcionando excelente sensibilidad para muchas impurezas iónicas tales como iones metálicos, cloruros y nitritos. Sin embargo, la detección directa de iones de soluto por UV es limitada en sensibilidad en comparación con la detección de conductividad para iones inorgánicos debido a la falta de un cromóforo selectivo. Por el contrario, la CI-CD está en desventaja cuando se trata de cuantificar nitritos en soluciones que contienen altos niveles de cloruros (p. ej., clorhidrato de metformina), los cuales interfieren fuertemente con la detección de nitritos (13,14).

Con respecto a excipientes poliméricos, la detección de nitritos a niveles bajos se complica aún más al identificar una técnica adecuada de preparación de muestras. Los polímeros lineales tales como povidona, específicamente grados de bajo peso molecular, se disuelven fácilmente en agua y tienen un efecto limitado en la columna de intercambio iónico o el detector de UV. Sin embargo, para la detección de conductividad, la alta concentración de polímero disuelto puede provocar la contaminación del supresor y la celda de conductividad.

Para polímeros insolubles o hinchables, no es posible la inyección directa y se deben emplear métodos de extracción. La extracción, en general, crea la necesidad de una mayor dilución en la preparación de la muestra, lo que afecta negativamente el límite de cuantificación de nitritos en el polímero. Una forma de contrarrestar esto es aumentar los volúmenes de inyección, pero entonces, es más probable que haya interferencia o co-elución de iones de la matriz con nitritos.

La detección espectrofotométrica de masas puede proporcionar una mayor sensibilidad y selectividad, pero puede ser más compleja en términos de operación e interpretación. Se publicó un artículo sobre detección de bajos niveles de nitritos en celulosa microcristalina, otro excipiente común (15). Si bien se logró un límite de detección notable (5 ppb) para este polímero, fue necesario el uso de un monitoreo de iones seleccionados, etiquetado de isótopos y una válvula de conmutación posterior a la columna para eliminar las sales de la fuente de iones.
El uso de un método CI-EM tal como este sería poco práctico para la detección de rutina de una amplia gama de excipientes poliméricos.

En este artículo, se presenta un método que combina CI con una detección espectrofotométrica visible, selectiva para nitritos y post-columna de un solo paso, más fácil de realizar, para permitir volúmenes altos de carga de muestra sin afectar la resolución. El paso de derivatización se basa en la conocida reacción de diazotación de nitritos con el sistema de reactivo mixto conocido como reactivo de Griess (0.05% de dihidrocloruro de naftiletilendiamina más 0.5% de sulfanilamida en ácido fosfórico al 5%) (16). El reactivo de Griess se vende comúnmente en kits de ensayo para determinación espectrofotométrica de nitritos en agua potable (límite de 1 ppm). También se ha utilizado para análisis de nitritos/nitratos en productos lácteos (17) y fluidos biológicos (plasma, orina y sobrenadante de cultivo celular) (18) a través de un proceso de dos pasos donde los aniones de nitrato primero se reducen a nitrito mediante un catalizador de cadmio y una posterior reacción de diazotación. Aquí, se utiliza para eliminar las interferencias de iones de la matriz mediante la detección del colorante azoico en su longitud de onda de absorción máxima, 540 nm.

La derivatización cromatográfica acoplada de nitritos de un solo paso mediante la técnica del reactivo de Griess, tanto antes como después de la columna para el análisis de nitritos, tiene ventajas significativas con respecto otros métodos tradicionales de detección/cuantificación de nitritos, tales como especificidad del método, sensibilidad, aplicabilidad y practicidad. Además, el método presentado aquí se puede aplicar ampliamente a múltiples tipos de excipientes poliméricos. Aquí se describe la utilización exitosa de la derivatización post-columna de CI para determinar niveles ultrabajos de nitritos en tres excipientes: povidona (plasdona K-29/32, Ashland), crospovidona (poliplasona XL, XL-10, Ashland) e hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) (benecel K100M XR, Ashland).

Método experimental
El procedimiento involucra disolución del polímero en una fase móvil acuosa (pH = 10), o mediante extracción con disolvente, para suministrar un alto volumen de muestra de inyección a la CI. Cualquier polímero soluble en la matriz de la muestra eluye rápidamente mientras que los nitritos se retienen en la columna de intercambio aniónico. Después de la columna, el eluato llega a una T de mezcla donde se intercepta con una solución fuertemente ácida de reactivo de Griess bombeada por una bomba auxiliar. El cambio a un pH bajo permite que comience la reacción de diazotación con cualquier nitrito en la muestra. Los reactivos fluyen a través de una bobina de reacción unida, lo cual permite un tiempo de reacción consistente para la formación del producto de colorante azoico. Luego, el producto de colorante se detecta mediante un espectrofotómetro de longitud de onda variable en la longitud de onda de absorción máxima del colorante. La concentración de nitritos se cuantifica mediante la calibración con estándares externos.

Instrumentación. La validación del método se completó en un sistema Dionex ICS-6000 HPIC (Thermo Scientific). Se utiliza una fase móvil de carbonatos de pH alto para estabilizar los aniones de nitritos presentes hasta que se derivatizan. El detector de longitud de onda variable está configurado para medir la longitud de onda de absorción máxima del colorante azoico a 540 nm. Las condiciones específicas del instrumento se enlistan en la Tabla I.



Preparación de reactivos, estándar y muestras. Los componentes del reactivo de derivatización son sulfanilamida y dihidrocloruro de N-1-naftil-etilendiamina, los cuales se compran fácilmente como sistema de reactivo de Griess. El reactivo de Griess se prepara al 1 % en ácido fosfórico al 5 %. El alto nivel de hidrógeno disponible en el medio ácido aumenta la velocidad de formación del colorante azoico cuando se encuentra con nitritos.

Los estándares (pH aproximadamente 11) se combinan en una matriz con el sistema de solvente utilizado en la preparación de la muestra. Por ejemplo, los estándares se preparan en fase móvil para medir niveles de nitritos en povidona soluble en agua, así como nitritos extraídos de crospovidona, mientras que el metanol se utiliza para la preparación del estándar cuando se determinan los niveles de nitritos en HPMC.

El método de preparación de la muestra depende de las propiedades de solubilidad del polímero. Las povidonas de bajo peso molecular y otros excipientes fácilmente solubles en agua se diluyen con fase móvil y se inyectan directamente en el sistema de CI. Específicamente para povidona, pesar 0.5 g de muestra en un vial de plástico de 10 mL, agregar 5 mL de carbonato de potasio 9 mM (fase móvil), colocar el vial de muestra en una rueda giratoria y mezclar suavemente durante 30 minutos para garantizar que la muestra esté completamente disuelta. Filtrar la solución a través de un filtro de jeringa antes de inyectar en el sistema de CI. Para polímeros que son insolubles, tal como crospovidona en agua, o que se hinchan, como HPMC en metanol, los nitritos deben extraerse con solvente. El exceso de polímero se elimina mediante centrifugación/filtración y el sobrenadante se inyecta en la CI. En algunos casos, puede ser necesaria la extracción a temperaturas elevadas. Específicamente para hidroxipropilmetilcelulosa, pesar 0.5 g de muestra en un tubo de centrífuga de plástico de 50 mL, añadir 10 mL de metanol y agitar inmediatamente a mano para dispersar la muestra antes de que se aglomere, colocar el tubo de centrífuga en una rueda giratoria y mezclar suavemente durante 30 minutos para garantizar la extracción completa de nitritos en metanol, centrifugar a 5000 G durante 10 minutos. Tomar aproximadamente 3 mL del sobrenadante y filtrar a través de un filtro de jeringa antes de inyectarlo en el sistema de CI.

Validación del método
Especificidad. La derivatización post-columna de nitritos permite eliminar cualquier compuesto en la matriz de la muestra que podría interferir potencialmente con la reacción de Griess, lo que permite un nivel significativamente alto de selectividad y especificidad. El tiempo de elución tanto en la fase móvil como en el metanol es de aproximadamente 12 minutos, como se muestra en las Figuras 1 y 2. En la Figura 1, el trazo negro corresponde a un estándar de nitritos de 7 ppb en la fase móvil contra el blanco de la fase móvil. La señal del blanco indica que hay algún aporte de nitritos de la propia fase móvil. Como este nivel de referencia de nitritos puede variar entre preparaciones, se recomienda que, para una mayor precisión, tanto los estándares como las muestras se preparen utilizando la misma fase móvil de carbonatos preparada proveniente del mismo recipiente, lo cual corregiría el bajo nivel de nitritos observado en la fase móvil.

En la Figura 2, el trazo negro corresponde a un estándar de nitritos de 7.5 ppb en metanol contra un blanco de metanol. La señal del blanco se reduce, presumiblemente debido a un nivel de nitritos más bajo en el metanol en comparación con la fase móvil. De origen desconocido, se observan múltiples picos superpuestos a los 6-8 minutos tanto en el blanco como en el estándar.

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