Próximos sistemas de expresión genética

Los sistemas de expresión biológica más sofisticados expanden la funciona-lidad de los sistemas tradicionales para la síntesis de proteínas.

Por Amy Ritter

SISTEMAS DE EXPRESIÓN

Amy Ritter

Los sistemas de expresión biológica más sofisticados expanden la funcionalidad de los sistemas tradicionales para la síntesis de proteínas.

La mayoría de los biofarmacéuticos que han alcanzado el mercado en los Estados Unidos y en la Unión Europea son producidos en sólo unos cuantos sistemas de expresión. Un reporte reciente en la edición de septiembre del 2010 del Nature Biotechnology indicaba que 32 de los 58 biofarmacéuticos aprobados entre 2006 – 2010 fueron producidos en sistemas de expresión de mamíferos (principalmente células de ovario de hámster Chino [CHO]), y 17 fueron producidos en Escherichia coli (E. coli). Los restantes fueron produci-dos en levaduras (4 en Saccharomyces cerevisiae, 1 en Pichia pastoris), animales trans-génicos, células de insectos, plantas o mediante síntesis directa (1).

La selección del mejor sistema de expresión depende de la complejidad del producto, del tamaño de lote y de las restricciones del costo, pero cada sistema viene con pros y contras. E. coli fue el primer sistema usado para producción comercial, con la comerciali-zación de insulina humana recombinante en 1982 (2). La bacteria es fácil de cultivar, prolifera rápidamente y puede desarrollarse en medios definidos, no costosos. En los casi 30 años desde entonces, los fabricantes han mejorado continuamente el sistema, optimizando las condiciones de cultivo, escalando los volúmenes de producción, y fomentando los rendimientos de proteína. Sin embargo, los sistemas de expresión de E. coli son limitados en los tipos de proteína que pueden producir, y son mejor usados para proteínas simples con pocas modificaciones post-translacionales. E. coli no produce proteínas glicosiladas, por ejemplo, ni puede producir correctamente proteínas grandes con patrones de plegado complicados o múltiples enlaces disulfuro. E. coli no secreta proteínas, lo que requiere que el fabricante haga pasos extra de purificación, incluyendo la lisis de las células, centrifugación, filtraciones múltiples y desnaturalización y el subsiguiente repliegue de la proteína. Las bacterias gram negativas como E. coli también contienen endotoxinas, las cuales deben ser eliminadas.

Las células de mamíferos se han convertido en el sistema de elección para la produc-ción de anticuerpos, que requieren de la mayoría de las modificaciones post-translacionales que no pueden lograrse en E. coli. Las células de mamífero –siendo las células CHO las más ampliamente usadas- están mejor equipadas para secretar proteínas glicosiladas, multi-subunitarias que se plegarán y ensamblarán correctamente. Éstas son dóciles a la manipulación genética, y existen líneas que han sido optimizadas para facilidad de transfección, mayor expresión de proteínas, y cultivos de alta densidad. El mayor inconveniente para las células de mamífero es que, en comparación con los micro-oganismos, éstas son más difíciles de cultivar, requieren costosos medios de cultivo y un entorno de baja alteración y con frecuencia producen bajos rendimientos. Existen también problemas de bioseguridad acerca de la transmisión de virus que pueden ser patógenos para los humanos.

Algunos participantes más recientes en el mercado se afanan para tratar algunos de estos inconvenientes. Uno de los más notables, el PerC.6, una línea celular humana transformada, desarrollada conjuntamente por Crucell y DSM para usarse como un sistema de expresión a escala de manufactura, aumentó los rendimientos de la expresión tan dramáticamente, que cambió las preocupaciones de los fabricantes de producir rendi-mientos de proteína adecuados a tener la capacidad adecuada para purificar eficiente-mente los títulos incrementados. El PerC.6 puede ser desarrollado en cultivos en suspen-sión a densidades relativamente altas en medio libre de suero, y de acuerdo a la literatura de la compañía, puede alcanzar rendimientos hasta de 8 g/L en cultivos estándar de lote alimentado y 20 g/L utilizando el sistema de cultivo propiedad de DSM, los cuales son niveles comparables a los de los sistemas de expresión microbiana.

Construyendo mejores bacterias
Aunque E. coli ha sido un pilar de la manufactura biofarmacéutica, otras bacterias pueden ofrecer ciertas ventajas sobre E. coli. Por ejemplo, Corynebacterium glutamicum es una bacteria del suelo gram positiva que ha sido usada durante décadas en las industrias de alimentos y farmacéuticas para producir aminoácidos, principalmente glutamato monosó-dico. A diferencia del sistema tradicional de E. coli, el C. glutamicum posee vías de secre-ción que pueden ser designadas para secretar proteínas construidas dentro del caldo de cultivo. Comercializado como sistema de expresión Corynex por Ajinomoto AminoScience, esta cepa secreta pocas proteínas endógenas, pero las proteínas construidas pueden ser dirigidas a una de dos vías de secreción, la vía de secreción (sec), o la vía gemela de arginina translocasa (tat). La vía sec inicia la secreción de proteínas desdobladas que posteriormente se pliegan en el caldo, mientras que la tat puede transportar proteínas plegadas, y por lo tanto es capaz de manejar proteínas más grandes. La expresión es constitutiva y no se requiere ningún sistema inductor. Joel White, gerente de negocios de biotecnología en Ajinomoto Aminoscience, dice que el crecimiento de Corynex es robusto: tiene un rápido tiempo de duplicación, sólo ligeramente más lento que E. coli y puede desarrollarse en medios definidos, no costosos, en bio-reactores estándar. La gran ventaja del sistema, de acuerdo a White, es que los pasos extra de lisis celular, centrifugación, y repliegue de proteínas no son necesarios, proporcionando de esta forma una ruta de purificación más simple, más rápida y menos costosa. White agrega que esta cepa amplía el espectro de proteínas plegadas que pueden ser producidas en un sistema de expresión bacteriana.

Otras compañías han estado diseñando E. coli para superar sus limitaciones en la pro-ducción de proteínas eucarióticas. New England Biolabs, por ejemplo, comercializa varias cepas diseñadas de E. coli que se usan principalmente para la producción de proteína a escala de laboratorio. Una de las cepas, conocida como SHuffle, ha sido construida para permitir la formación de enlaces disulfuro en el citoplasma. En la E. coli silvestre, las re-ductasas en el citoplasma inhiben la formación de enlaces disulfuro manteniendo los resi-duos de cisteína en su forma reducida. Se han eliminado dos reductasas en la cepa SHuf-fle, y una versión de una isomerasa periplásmica de enlace disulfuro ha sido dirigida al citoplasma, lo que ayuda a corregir los enlaces desoxidados (‘misoxidized’) y promueve el plegado apropiado. Los datos de la compañía muestran que la cepa SHuffle es capaz de producir activador biológicamente activo del plasminógeno tisular truncado, una proteína que contiene nueve enlaces disulfuro cuando está plegada correctamente. De acuerdo al Dr. James Samuelson, un científico del grupo en New England Biolabs, la cepa crece bien en fermentadores y produce altos rendimientos de proteína. Aunque el mayor interés en la cepa proviene de los laboratorios académicos, otras compañías, incluyendo fabricantes, también han expresado interés.