Análisis microbiológico rápido Evaluación de diferentes métodos y sus aplicaciones

Los métodos tradicionales de análisis para la contaminación microbiana de cultivos de células de mamífero requieren de varios días para detectar la contaminación. La presencia de microorganismos es valorada típicamente mediante filtración por membrana e incubación sobre medios sólidos o inoculación en medios líquidos. Estos métodos basados en cultivos se apoyan en microorganismos que crecen y producen colonias visibles o turbidez. El tiempo para el resultado se mide en días para el análisis estándar de la biocarga (1). El método de tinción fluorescente de microcolonias (MFSM) descrito en este estudio es un método robusto, simple y rápido que facilita la detección de contaminantes microbianos. Puede aplicarse a muestras de cultivo celular con un tiempo para tener resultados que es de dos a cinco veces más corto que el microbiológico tradicional. La característica no destructiva los hace compatible con la identificación de contaminantes corriente abajo.

La necesidad de la velocidad. Muchas tecnologías y sistemas de detección tales como los ensayos de inmunoabsorción ligada a enzimas, la impedimetría, la bioluminiscencia, la citometría de flujo, y la reacción de la cadena de polimerasa surgieron en el campo de la detección rápida durante las dos décadas pasadas (2-4). Los pigmentos fluorescentes han sido utilizados rutinariamente en métodos tales como la técnica directa en filtro epifluorescente (DEFT) para monitorear la contaminación microbiológica (5). Esta técnica involucra la captura de microorganismos en la superficie de filtros de membrana de policarbonato, tinción y visualización utilizando microscopía epifluorescente. La sensibilidad está directamente vinculada al volumen filtrado y el número de campos observados. Una limitación de esta técnica es la incapacidad para diferenciar los microorganismos fluorescentes de las partículas autofluorescentes. Se han desarrollado sistemas automatizados y semi-automatizados para incrementar esta discriminación y mejorar la exactitud (6-8).

Muchas técnicas de marcado fluorescente tienen impacto sobre la viabilidad de la formación de colonias.



Una alternativa es combinar los principios de la microscopía de epifluorescencia y la citometría de flujo (9). Los microorganismos retenidos en un filtro de policarbonato son marcados fluorescentemente y contados automáticamente mediante un dispositivo de exploración con láser que hace la diferenciación entre los microorganismos fluorescentes y las partículas (10). Varios autores han reportado el uso de esta tecnología de citometría en fase sólida para el análisis de la biocarga de procesos de cultivo de células de mamífero (1). Los resultados se obtienen típicamente dentro de un lapso de cinco horas a partir de la preparación de la muestra (6). Un inconveniente de dichos métodos de detección directa es la incapacidad para discriminar entre organismos cultivables y no cultivables (11). Además, muchas técnicas de marcado fluorescente tienen un impacto sobre la viabilidad de la formación de colonias, haciendo así imposible identificar organismos que son detectados. Este es un desafío cuando se realizan investigaciones o se evalúa la severidad de una contaminación.

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