Consideraciones experimentales en la cromatografía de gases con headspace

Un estudio de caso de aminas

Laila Kott y Hong Ming Chen


Figura 1. Efecto del volumen de la muestra sobre el volumen del headspace en los viales de la muestra.

Los autores discuten diversos parámetros a ser considerados en el desarrollo de un método por cromatografía de gases con headspace. Ellos examinan el volumen de la muestra en el vial de headspace, el tiempo de equilibrio del vial, y la composición del diluyente. Estos parámetros son puestos de relieve mediante un estudio de caso que utiliza una serie de aminas que sirven como bases en el proceso farmacéutico.

La cromatografía de gases (CG) con headspace ha sido utilizada desde la década de los 80’s, pero sólo recientemente se ha convertido en parte de la corriente principal del análisis farmacéutico. La Farmacopea de los Estados Unidos (USP) incorporó la técnica en el 2007 dentro de su Capítulo General <467> “Solventes Residuales.” La USP define el uso de la CG con headspace para el análisis de impurezas volátiles orgánicas (IVOs) o, más comúnmente, solventes residuales (1). Un beneficio primario del uso de la CG con headspace es que uno puede analizar pequeñas cantidades de solventes residuales enterrados en una gran cantidad de matriz (es decir, el ingrediente activo farmacéutico) sin tener que inyectar la matriz en la columna cromatográfica. Esta técnica resulta en una preparación limpia y fácil de la muestra junto con menos uso de las columnas cromatográficas y del instrumento de CG ya que hay menos compuesto pasando a través del inyector o del revestimiento de inyección y el detector.

Definición de headspace
El proceso descrito en este estudio es conocido más exactamente como headspace estático. Sin embargo, como no se discutirán otras técnicas de headspace, sólo se utilizará el término headspace. La metodología para el headspace es muy simple. Una muestra se diluye y se pone en un contenedor cerrado y sellado que es lo suficientemente grande para permitir algo de espacio vacío el vial en donde los vapores pueden colectarse. La muestra se calienta a temperatura controlada durante un período de tiempo para permitir que los solventes de la matriz se volatilicen, entren en fase gaseosa, y alcancen el equilibrio con el o los solventes restantes en el vial. Esta fase gaseosa es el headspace, el cual se muestrea y se inyecta en la columna utilizando presión como el modo de inyección. La precisión de la inyección de un inyector de headspace puede dar consistentemente < 10.0% de desviación estándar relativa (DER) y frecuentemente da = 2.0% DER, similar a la precisión encontrada con la inyección en cromatografía de líquidos.
Los autores estudiaron aminas orgánicas básicas, pequeñas, las cuales son comúnmente utilizadas en procesos farmacéuticos en lugar de bases más tradicionales como el hidróxido de sodio o el etóxido de sodio. El uso de estas aminas presenta varios retos analíticos. Las guías de la Conferencia Internacional de Armonización (ICH) no incluyen límites para muchas de dichas aminas; siendo la piridina la principal excepción (2). El valor blanco para la especificación de tales aminas puede ser asignado por el químico o por el departamento de aseguramiento de la calidad, lo cual puede llevar a que la misma amina tenga muy diferentes límites establecidos. Como las especificaciones con frecuencia se establecen en el nivel más bajo que tolerará el proceso, es importante tener un método eficiente que pueda detectar bajos niveles de estas pequeñas aminas orgánicas. Los problemas analíticos adicionales con estos compuestos incluyen forma de picos no Gaussianos debido a las interacciones con la columna de CG, y a la baja detección con ionización de flama (FID) basada en el tamaño del compuesto y bajas cantidades de grupos de carbono oxidables (vía el quemado).

Consideraciones experimentales
Esta investigación se centró en algunos parámetros del headspace que deberían ser considerados cuando se desarrolla un método con headspace, con el objetivo de maximizar la señal y la sensibilidad mientras se usa eficientemente el tiempo y los materiales. Todos estos parámetros son importantes en las primeras etapas del desarrollo de fármacos; no obstante, un método sensible, rápido y eficiente también es benéfico para los laboratorios de control de calidad que liberan fármacos aprobados. Los autores evaluaron parámetros experimentales que incluyeron la muestra de volumen en el vial del headspace, el tiempo de incubación en el horno del headspace y la composición del diluyente. Las tres aminas seleccionadas (trietilamina, nbutilamina y alilamina) representan una sección transversal de las aminas orgánicas que han sido analizadas por los autores durante los procesos de escalamiento.
Volumen de la muestra. Los viales de muestra para headspace típicamente vienen en tamaños de 10 mL y 20 mL. Con frecuencia, el químico analista necesita analizar una cantidad muy pequeña de un solvente residual en una matriz, lo que genera el problema de la sensibilidad. Tradicionalmente, el químico analítico incrementaría la concentración de una muestra o inyectan más muestra en una columna para obtener una mejor señal, incrementando así la potencia de la señal. Con el headspace, más volumen de muestra no siempre proporciona el incremento esperado en las cuentas de área porque a más grande el volumen de muestra, menor es el volumen del headspace real (ver Figura 1). El artículo describe el efecto que el volumen de la muestra tiene en respuesta para trietilamina, nbutilamina y alilamina en diferentes diluyentes.
Tiempo de incubación. El equilibrio solventevapor juega un papel en el análisis del headspace. Mientras más rápidamente pueda evaporarse un solvente dentro del headspace, más de ese solvente particular será inyectado en la columna. La incubación del vial de headspace es una consideración importante en el desarrollo de métodos por CG con headspace. Si la muestra se incuba durante un período de tiempo demasiado corto, menos del analito estará en el headspace, lo cual puede afectar las cuentas de área generales. Después de un cierto punto, sin embargo, el analito y la solución de la cual proviene se asentará en equilibrio; más incubación no resultará en más muestra que entre a la fase de vapor y puede resultar en la degradación de la muestra o causar reacciones secundarias. Los autores variaron el tiempo de incubación de las muestras de trietilamina, nbutilamina y alilamina y reportaron el cambio en la respuesta del solvente con el tiempo.
Composición del diluyente. La sal genera el punto de ebullición del agua afectando el equilibrio de un solvente con su vapor. Como el headspace también depende de los equilibrios solventevapor, dichas técnicas también pueden ser usadas para incrementar la concentración de vapor en una muestra de CG con headspace. Las sales han sido usadas en el análisis de headspace (35); sin embargo, esta técnica trabaja mejor para solventes con base acuosa, los cuales no son los mejores solventes para el análisis de CG. Los autores, por lo tanto, utilizaron solventes de alto punto de ebullición como el dimetilsulfóxido (DMSO) y dimetilformamida (DMF) como diluyentes de la muestra. Los autores variaron el porciento de agua (acuoso) en el diluyente para ver si el mezclado en un solvente con una alta presión de vapor afectaría la concentración de los solventes volátiles en el headspace.