Análisis de terapias y vacunas de ARNm

A diferencia de la mayoría de los demás fármacos, el ARNm debe formularse dentro de nanopartículas especializadas, que generalmente consisten en lípidos, tanto para protegerlo de la degradación como para facilitar su tránsito a través de las membranas celulares. Por lo tanto, se requieren pruebas analíticas adicionales para garantizar la calidad y la seguridad de la formulación de nanopartículas, así como de la molécula de ARNm en sí.

Una actividad clave en la etapa inicial de desarrollo de terapias con ARNm es la caracterización exhaustiva de los atributos de calidad del ARNm y las nanopartículas, ya que se sabe que influyen fuertemente en la eficacia biológica. Dada la reducción de los plazos para el desarrollo de medicamentos, el acceso a métodos analíticos más rápidos y de mayor rendimiento se ha vuelto vital. De hecho, es esencial que los enfoques analíticos para usarse durante el desarrollo de productos de ARNm y las pruebas de control de calidad (CC) sigan el ritmo para garantizar la identidad, la seguridad y la eficacia de estas nuevas modalidades profilácticas y terapéuticas.

Amplia gama de necesidades analíticas
Aunque los requisitos analíticos para los candidatos de ARNm son más complejos que los de los productos biológicos tradicionales, algunas necesidades de prueba son similares mientras que otras son bastante diferentes. “Existe una necesidad común de caracterizar adecuadamente tanto las terapias de proteínas como las terapias de ARNm para identificar y cuantificar con confianza cualquier atributo de calidad que afecte su eficacia y seguridad,” dice Todd Stawicki, gerente de marketing global, espectrometría de masas, para la industria biofarmacéutica en SCIEX. Señala la necesidad de identificar impurezas relacionadas con el proceso, proteínas de la célula huésped en el caso de las proteínas terapéuticas y una variedad de impurezas genéticas como transcripciones truncadas o plantillas de ADN incorrectas en el caso del ARNm.

Las diferencias son notables, sin embargo. En lugar de centrarse en las modificaciones postraduccionales como es el caso de las proteínas terapéuticas, se pone mucho énfasis en la caracterización del ARNm, los sistemas de administración y la captación celular en la fase de descubrimiento del desarrollo del medicamento porque, a diferencia de las proteínas manipuladas y los anticuerpos monoclonales (AcM) que están listos para comenzar a funcionar en al momento de la administración, el ARNm, una vez administrado a las células, proporciona instrucciones para producir las proteínas que hacen el trabajo, según Brian Liau, científico de desarrollo de soluciones en Agilent Technologies, Singapur.

Además, la fabricación de productos de ARNm requiere pasos del proceso únicos, como la transcripción in vitro (TIV) y la formulación de nanopartículas lipídicas, lo que naturalmente crea diferentes necesidades analíticas, agrega Ryan Hanko, gerente de control de calidad en Catalent. La TIV es un proceso químico más que basado en células, explica Joe Fredette, gerente sénior de desarrollo comercial de productos biofarmacéuticos en Waters. También implica el uso de una enzima llamada ARN polimerasa que transcribe el ADN en ARNm.

Como ejemplo de diferentes necesidades analíticas, Hanko señala que los productos de ARNm requieren que se desarrollen ensayos de CC que midan la enzima residual (como la polimerasa o la endonucleasa), la cual puede estar presente después del paso de la TIV, para garantizar que no esté presente en el producto final. La confirmación de la secuencia de ARN y la determinación de la eficacia del capuchón en el extremo 5' y la distribución de la cola de poli(A) en el extremo 3' también son exclusivos del ARNm, señala Ashleigh Wake, directora de desarrollo empresarial en Intertek Pharmaceutical Services. El perfil de impurezas potenciales también es bastante diferente al de otras moléculas, y también se requieren métodos para cuantificar cualquier plásmido o ARN de doble cadena residuales.

Además, los flujos de trabajo de análisis de lípidos son necesarios para pruebas de caracterización y de química, fabricación y controles (CMC, por sus siglas en inglés) de productos de ARNm, incluyendo el análisis de composición de nanopartículas líquidas (NPL) para garantizar la proporción de mezcla correcta de lípidos dentro de la formulación, confirmación de identidad de lípidos y análisis y detección de impurezas, de acuerdo con Fredette.

En esencia, resume Wake, existe una similitud en los requisitos generales para la caracterización del producto en el sentido de que la intención es evaluar o confirmar identidad, pureza/impurezas, estabilidad, actividad, etc. “Sin embargo,” destaca “para cumplir esto en su totalidad existe la necesidad de incluir análisis específicos de ARNm que permitan la evaluación de estos atributos.”

Necesidades analíticas en evolución desde etapas tempranas hasta etapas posteriores del desarrollo
Otra diferencia importante entre el desarrollo de productos basados en proteínas y ARNm es la carga analítica durante la fase de descubrimiento inicial. Dado que el desarrollo tradicional de medicamentos suele implicar AcM, dice el Dr. Liau, los requisitos bioanalíticos tienden a ser relativamente modestos porque incluso las moléculas subóptimas pueden utilizarse para demostrar la interacción con el blanco y un efecto terapéutico. En contraste, los productos de ARNm requieren varios procesos biológicos, incluida la captación celular, el escape endosomal y la traducción en proteínas para que tengan lugar de manera eficiente antes de que se pueda observar cualquier efecto. Por lo tanto, la caracterización analítica del ARNm y los atributos de calidad del vehículo de administración son importantes desde el principio.

“Para el escalamiento del proceso y el lanzamiento/fabricación GMP (buenas prácticas de fabricación) del producto, la caracterización química del ARNm sigue siendo importante. Sin embargo, el enfoque tiende a cambiar hacia garantizar polidispersidad de tamaño consistente y encapsulación de ARNm en el producto formulado, así como identificar impurezas relacionadas con el proceso,” comenta el Dr. Liau.

Con los candidatos de ARNm, Stawicki agrega que el escalamiento del proceso enzimático requiere un escalamiento significativo y difícil para todas las materias primas de etapas iniciales del proceso: nucleósidos trifosfato, enzimas, reactivos de bloqueo, cofactores y múltiples clases de lípidos. “La mayoría de estos componentes son biomoléculas grandes y complejas con sus propios desafíos asociados de escalamiento, de purificación y analíticos,” explica.

También existen algunas diferencias en los atributos que se monitorean durante la producción, según Hanko. Las verificaciones de concentración A260 y las pruebas de osmolalidad son los ensayos de monitoreo primarios en el desarrollo temprano y el escalamiento del proceso para observaciones durante el proceso, mientras que durante la fabricación GMP, las pruebas de ARNasa son importantes para garantizar que el producto final no se vea comprometido por la contaminación incidental de materiales que no son productos.

Las pruebas de liberación principales incluyen determinaciones de identidad, concentración final, contenido de impurezas (p. ej., proteínas residuales, ARN de doble cadena, ADNr), eficiencia de bloqueo y cola de poli-A, además de evaluaciones compéndiales comunes de atributos de seguridad y calidad.

Muchos atributos críticos de calidad
Hay una lista extensa de atributos críticos de calidad (ACC) que deben monitorearse para cumplir con los requisitos regulatorios con respecto a la evaluación de identidad, funcionalidad y seguridad de los productos terapéuticos/vacunas de ARNm (ver Tabla I). “Se requerirá confirmación de que se generó la secuencia de ARNm específica, que la solución de ARNm tiene el pH deseado y que se controló cualquier posible impureza del proceso (solventes, proteínas, relacionadas con el ADN),” dice Matthew Howard, un especialista sénior de aseguramiento de calidad en Catalent.



También será necesario asegurarse de que las características de promoción de la traducción y de prevención de la degradación del capuchón de 5' y la cola de poli-A sean suficientes, dice Howard. La eficacia del capuchón en el extremo 5' puede influir tanto en la producción de la proteína deseada como en la inmunogenicidad general, mientras que la longitud/distribución de la cola de poli(A) es fundamental para la traducción y la protección general del ARNm, explica Wake.

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